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，经核酸内切酶BamHI和EcoRI双酶切后,电泳鉴定bcl-2核酶片段的大小。把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组:对照组(SMMC7721细胞)和实验组(转染PMTrneo的7721细胞)。转染方法按脂质体转染试剂盒中的说明书操作步骤进行。培养48h后，传代、加入含G418550mg/L的培养液，筛选抗性细胞。继续培养2wk后，可见细胞克隆形成。
1.2.2SMMC7721/PMTrneo细胞的鉴定细胞克隆扩大培养后,制作细胞爬片,加入100μmol/L硫酸锌，诱导bcl-2核酶表达。爬片经丙酮固定后，以免疫组化法检测bcl-2的表达情况。所用抗bcl-2、
单抗(mAb)购自中山生物公司。免疫组化的步骤如下：(1)以30mL/LH2O2－甲醇封闭30min；(2)再以30g/LBSA封闭30min；(3)加一抗(抗p16，抗p21和抗bcl-2mAb)4℃过夜；(4)加HRP抗鼠IgGABC复合物(Dako公司产品);(5)显色、苏木精衬染。以上各步骤均用0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，光镜下观察结果。
1.2.3bcl-2核酶的诱导表达SMMC7721/PMTrneo细胞克隆转移扩大培养后，加入硫酸锌100μmol/L诱导bcl-2核酶表达。24h后换液，继续培养3d后，分别检测细胞凋亡及p16和p21的表达。
1.2.4bcl-2核酶的促凋亡作用(1)原位爬片的TUNEL原位杂交检测：检测凋亡方法的步骤参照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行，简述如下：①细胞爬片用多聚甲醛室温固定30min；②加1mL/LTritonX100和1g/L枸椽酸钠4℃2min；③加TUNEL反应混合液50μL，37℃60min；④加碱性磷酸酶转换液50μL，37℃30min；⑤加50μL底物液，室温10min。以上各操作步骤均用0.01mL/LPBS洗涤，光镜下观察结果。在高倍视野下计数200个细胞，计算凋亡细胞所占数量的百分比。(2)p16和p21的免疫组化检测：所用抗p16和抗p21单抗(mAb)均购自中山生物公司。免疫组化的步骤同1.2.2中所述。光镜下观察结果。在高倍视野下计数200个细胞，应用HPIAS1000图文报告管理系统进行处理，检测细胞的平均光吸收(A)值。
2 结果
2.1TUNEL原位杂交检测光镜观察可见凋亡细胞胞浆减少、体积变小、固缩，阳性信号呈深蓝色、团块状分布于细胞内或细胞核中。SMMC7721/PMTrneo细胞较对照组细胞的凋亡数量显著增多(图1)。在高倍视野下，选择5个视野分别计数200个细胞，计算凋亡细胞所占百分比。发现SMMC7721/PMTrneo细胞组凋亡细胞 为24±4/200(12％)，比对照组(8±3/200,4％)明显增多，统计学检验表明，发生凋亡的细胞数量在两组细胞之间有显著的差别(P∨0.01，2=7.643)。 2.2免疫组化检测光镜观察bcl-2，p16和p21蛋白主要分布在细胞浆中，p16和p21蛋白也可分布在细胞核中，阳性信号呈棕黄色颗粒。在SMMC7721/PMTrneo细胞中，未能检测到bcl-2蛋白，而对照组bcl-2结果为阳性，说明在Zn2＋诱导下bcl-2核酶有效表达,在转录水平上封闭了bcl-2mRNA的表达。免疫组化检测p16和p21蛋白的表达发现，在对照组细胞中p16和p21的表达呈弱阳性，且阳性表达细胞数少，分布散在；而在SMMC7721/PMTrneo细胞中p16和p21的表达呈强阳性，且阳性表达细胞数多、分布均匀(图2)。图像分析测定两组免疫组化染色中p16，p21阳性细胞的A值，SMMC7721/PMTrneo细胞组分别为：0.23±0.06，0.26±0.02；对照组分别为：0.18±0.02，0.19±0.03。SMMC7721/PMTrneo细胞组较对照组细胞表达p16和p21蛋白的水平显著增高，统计学检验表明，p16和p21的表达程度在两组细胞之间均有显著的差别(P均∨0.05)，提示通过转染bcl-2核酶抑制bcl-2表达后,p16与p21的表达水平有明显的增加。
3 讨论
抗凋亡基因bcl-2是肿瘤研究中最受关注的癌基因之一。研究发现，bcl-2过量表达可阻断多种刺激引起的细胞凋亡，延长细胞的生存期；抑制bcl-2的表达，可在多种肿瘤中引起细胞凋亡〔1－3〕。对凋亡调控的研究发现，bcl-2的抗凋亡作用主要是通过竞争性形成不同的二聚体形式而发挥作用〔4－5〕。例如，bcl-2与bak结合成杂交二聚体，便可以抑制bak的促凋亡作用。最近研究还表明，bcl-2可阻止细胞进入细胞周期及引起细胞对化疗药物的抗性。因此，对bcl-2更深入地研究具有重要的意义。本实验将带有锤头状bcl-2核酶的可诱导的真核表达载体〔11〕，通过脂质体介导方法转入SMMC7721培养细胞中,通过bcl-2核酶来阻断bcl-2基因表达。结果表明，转染bcl-2核酶的SMMC7721细胞表达bcl-2的水平显著下降。用免疫组化法未能检出SMMC7721细胞中有bcl-2蛋白；用TUNEL原位杂交方法检测到转染细胞发生显著凋亡。有关bcl-2核酶对肿瘤细胞的促凋亡作用，文献报道结果不一。Dorai等〔6－7〕观察到bcl-2核酶对前列腺癌细胞有明显的促凋亡作用；而有人发现bcl-2核酶对慢性髓细胞白血病细胞无明显的促凋亡作用〔8〕。我们的实验结果与Dorai等的结论相似，说明bcl-2核酶对肝癌细胞有一定的促凋亡作用，验证了bcl-2抑制凋亡的作用。同时我们观察到，转染bcl-2核酶的细胞中p16和p21的表达水平增加。p16和p21均在细胞周期调控表达中起重要作用，均属于细胞周期蛋白激酶抑制蛋白，对G1/S转换起负调节作用〔9－10〕。p16和p21通过影响CDK的活性可阻止细胞进入S期；p21在转录水平还受P53调控。因此，可以推测bcl-2核酶封闭bcl-2基因表达后，可引起p16和p21表达水平的增加，进而可能会影响细胞周期调控，G1/S期转换受阻；同时，由于bcl-2基因表达受抑或降低，相对表达增加的p53可上调p21表达，加剧细胞凋亡。由于对bcl-2核酶进入细胞后的表达情况不清楚,我们推测，通过转染bcl-2核酶抑制bcl-2表达后,p16与p21表达水平的增加可能是继发性的，对此有待于更深入地研究。■
作者简介：张传山，男，33岁，博士生西安市长乐西路17号 ，T
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